Een tijdje geleden werden we benaderd door Elmas en Dominique van de Avans Hogeschool. Ze wilden een onderzoek doen naar de hersenontwikkeling van een kippenembryo. Het leek ons ontzettend interessant en natuurlijk wilde we aan dit onderzoek bijdragen. In het onderzoek hieronder kun je de bevindingen van Elmas en Dominique lezen.

De hersenontwikkeling van een kippenembryo

Elmas Solak en Dominique Viveen, Avans Hogeschool, maart'18

Abstract

Gedurende het onderzoek zijn er 24 verse broedeieren gebruikt. De embryo's zijn op microscopisch niveau vergeleken op de dagen 5, 7 en 9, hierbij werd de nadruk gelegd op de hersenontwikkeling.

Met behulp van de Toluidine blauw kleuring zijn o.a. de gliacellen aangetoond. Astrocyten zijn gliacellen die een rol spelen bij de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel. Ze vormen de uitlopers waarlangs de neuronen kunnen groeien. Er werd verwacht dat gedurende de hersenontwikkeling het aantal gliacellen zal toenemen ^[5]. Uit de microscopische resultaten blijkt dat de gliacellen moeilijk te tellen zijn. In vervolg onderzoek zou een immunohistochemische detectie uitgevoerd kunnen worden met het antilichaam 'Glial Fibrillary Acidic Protein Ab-6 (GFAP)' om de astrogliacellen te detecteren ^[6][7].

Introductie

Het onderzoek dat uitgevoerd is, gaat over de hersenontwikkeling van een kippenembryo. Het overkoepelende thema van dit project is histologie. Voordat het onderzoek opgestart kon worden, moest er rekening worden gehouden met de wetgeving. Artikel 25b van de Embryowet laat weten dat het verboden is om een tot stand gebrachte chimère langer dan 14 dagen te laten ontwikkelen, dit geldt voor zowel humane als dierlijke embryonale cellen ^[1].

De hersenontwikkeling van een humaan embryo komt overeen met de hersenontwikkeling van een kippenembryo. Als eerst vind de ontwikkeling van de primaire fase van de hersenen plaats. De grote hersenen (cerebrum) en de kleine hersenen (cerebellum) zijn één geheel. Hierna worden de grote hersenen en de kleine hersenen gescheiden van elkaar, dit is de secundaire fase. Tijdens de primaire fase ontwikkelen de basisonderdelen van de hersenen. Uit de prosencephalon worden de grote hersenen gevormd, de mesencephalon vormen de middenhersenen, het rhombencephalon vormen de rest van de hersenstam en de kleine hersenen. Tot slot vormt het uiteinde van de neurale buis het ruggenmerg ^[4], zie afbeelding 1.

Tijdens de secundaire fase vormt vanuit de proscencephalon het telencephalon en de diencephalon. Het telencephalon vormt de hersenbol en groeit sneller in verhouding met de kleine hersenen. Het diencephalon bestaat o.a. uit thalamus en hypothalamus. Het mesencefalon wordt niet verder onderverdeeld. Tot slot zal het rhombencephalon zich onderverdelen in het metencephalon en het myelencephalon. Het metencephalon zal de pons en de kleine hersenen vormen en het myelencephalon zal de medulla vormen ^[4], zie afbeelding 2. De pons is een verbinding tussen de grote hersenen en de kleine hersenen en maakt deel uit van het centraal zenuwstelsel. Het ligt tussen het ruggenmerg en de tussenhersenen en is onderdeel van de hersenstam.

Afbeelding 1. Primaire fase van hersenontwikkeling, humaan

Afbeelding 2: Secundaire fase van hersenontwikkeling, humaan(4)

Gedurende het onderzoek werden 24 verse broedeieren gebroed. De embryo's van de dagen 5, 7 en 9 werden bewaard in xyleen totdat ze ingebed konden worden. Na het inbedden van het weefsel, zijn er coupes gesneden m.b.v. een microtoom en preparaten gemaakt. De Toluidine blauw kleuring werd gebruikt om de histologische structuren van de hersenholtes te beoordelen onder een microscoop. De Toluidine blauw kleuring is een basische thiazine etachroatische kleurstof die de zure weefselcomponent.

en van een cel kleurt. Het kleurt nucleïnezuren blauw en polysachariden paars ^[2].

Materialen en Methoden

Gebruik van broedmachine

De broedmachine (Budget incubator, Kleinveeservice) werd op een stabiele ondergrond geplaatst en een dag van tevoren aangezet op 37,5^oC. De luchtvochtigheid was ingesteld op 60% (dit kan variëren tussen 40-60%). Hierna werden de eieren in de broedmachine geplaatst met het stompe uiteinde naar boven gericht. Het rotatiesysteem wiegde de eieren om de twee uur. Op de dagen 5, 7 en 9 werden een aantal eieren uit de broedmachine gehaald. Vervolgens zijn de embryo's uit de eieren gehaald en bewaard in buizen die xyleen bevatten.

Inbedding van weefsel

Eerst werden de weefsels gefixeerd volgens het formaline fixatieprotocol in de weefselverwerker (Leica ASP300 S). Hierna is het weefsel bedekt met paraffine (Klinipath) met behulp van een inbeddingsapparaat (Leica). Vervolgens werden de coupes met een dikte van 7 μm gesneden met behulp van een microtoom (Leica). Alle coupes werden gesneden als mediaan secties, zie afbeelding 3.

Afbeelding 3: Schematische doorsnede van kippenembryo^[3]

Deparaffineren van preparaten

De preparaten zijn gedeparaffiniseerd door ze tweemaal in formaline te plaatsen en ze vervolgens tweemaal in 100% alcohol te plaatsen, beide gedurende 2 minuten. Daarna zijn de preparaten opnieuw gehydrateerd door ze gedurende één minuut in 90% ethanol te plaatsen en ze vervolgens gedurende twee minuten in 70% ethanol te brengen. Tot slot zijn de preparaten in gedemineraliseerd water gebracht.

Toluidine blauw kleuring

Eerst werd de 0,1% Toluidine blauw oplossing bereid door 0,1 gram Toluidine blauw poeder (Sigma Aldrich) op te lossen in 100 ml gedemineraliseerd water. De preparaten zijn gekleurd met de oplossing gedurende 30 seconden. Hierna zijn de preparaten gewassen met gedemineraliseerd water. De preparaten zijn vervolgens gedehydrateerd, gedroogd en voorzien van een dekglaasje. Tot slot zijn de preparaten onder een microscoop beoordeeld (Primostar, Zeiss) ^[2] .

Resultaten

Er waren maar 8 van de 24 eieren bevrucht. Op dag 5 zijn er 2 embryo's verkregen, op dag 7 en 9 zijn er 3 embryo's verkregen. In afbeelding 4 is de Toluidine Blauw kleuring van het kippenembryo van dag 5 weergegeven. Er is te zien dat de grote hersenen (B) en de kleine hersenen (C) van elkaar gescheiden zijn. In afbeelding 5 zijn de gliacellen weergegeven (D).

Afbeelding 4: Kippenembryo dag 5, Toluidine Blauw kleuring (40x vergroting), A: Oog, B: Grote hersenen, C: Kleine hersenen, D: gliacellen

Afbeelding 5: Kippenembryo dag 5, Toluidine Blauw kleuring (100x vergroting) D: gliacellen

Discussie

De hersenholtes zijn meer van elkaar gescheiden in verloop van de dagen, maar het verschil was niet relevant genoeg om de ontwikkeling mooi weer te geven. Sommige preparaten zijn niet gebruikt in het onderzoek omdat het weefsel erg beschadigd was door het snijden m.b.v. een microtoom.

Ook zijn enkele coupes dieper gesneden in vergelijking met de andere coupes, dit zorgt voor zichtbaar verschil in grootte van de hersenholtes. De coupes van dag 5 gaven de hersenholtes het mooiste weer vergeleken met dag 7 en 9. Daarom is er gekozen om de coupes van dag 5 weer te geven. In vervolg onderzoek zou een immunohistochemische detectie uitgevoerd kunnen worden met het antilichaam 'Glial Fibrillary Acidic Protein Ab-6 (GFAP)' om de astrogliacellen te detecteren ^[6][7].

Dankwoord

Voor u ligt het artikel 'De hersenontwikkeling van een kippenembryo'. Geschreven door Elmas Solak en Dominique Viveen, studenten Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek aan Avans Hogeschool te Breda. In het bijzonder willen we 'Kleinveeservice' bedanken voor het lenen van de broedmachine, de 'Young Poultry People' voor de broedeieren en Ans Arets voor haar kennis en hulp.

Breda, maart'18

Literatuurlijst

[1] Rijksoverheid, 14-09-17, Artikel 25b Embryo Wet.

[2] E. Smit, 2006. 'Combining the gold chloride and toluidine blue stains to investigate chick embryo neural tissue'. Journal of Microscopy p.26-32

[3] Onbekend, Schematic cross-section of chicken embryo, 18-12-2017

[4] Neuroscientifically Challenged. 2-Minute Neuroscience: Early Neural Development https://www.neuroscientificallychallenged.com/blog/2-minute-neuroscience-early-neural-development, November 07, 2014

gliacellen

[5] Verkhratsky, A.; Butt, A.M. "Numbers: how many glial cells are in the brain?". Glial Physiology and Pathophysiology. John Wiley and Sons. p. 93–96 (2013).

[6] Debus E, et. al. Differentiation, 1983, 25(2):193-203.

[7] Yachnis AT; et al. Journal of Comparative Neurology, 1993, 334(3):356-69. Trivino A; et al. Vision Res, 1992, 32(9):1601-7